作者：Mark Webber1，Elaine Humphrey2
1 加拿大(dà)BC省加利亞諾島(Galiano Island)矽藻資深研究員
2 美國(guó)顯微學會會士，前加拿大(dà)顯微學會主席，現任加拿大(dà)維多利亞大(dà)學高級顯微鏡中心項目經理
現有方法存在(zài)哪些問題？
矽藻殼面和(hé / huò)殼環帶面（即帶面）的(de)顯微形态是(shì)屬、種水平矽藻鑒定的(de)重要(yào / yāo)依據。常規掃描電鏡（SEM）觀察矽藻樣品的(de)方法是(shì)将矽藻樣品去有機質處理後置于(yú)平整載體（如玻片、掃描電鏡樣品座、碳導電膠、濾膜等）上(shàng)觀察，其缺點是(shì)：
- 通常僅能觀察到(dào)矽藻一(yī / yì ／yí)個(gè)角度（殼面方向或帶面方向）上(shàng)的(de)結構，而(ér)該角度多數情況下不(bù)是(shì)拍攝矽藻照片或鑒定矽藻種類的(de)理想方向（見圖1）；
- 爲(wéi / wèi)滿足鑒定要(yào / yāo)求，需尋找角度理想的(de)矽藻或者傾斜和(hé / huò)旋轉樣品座、調節電鏡參數以(yǐ)觀察矽藻不(bù)同方向上(shàng)的(de)結構（實際上(shàng)仍難獲得理想的(de)拍攝角度），而(ér)這(zhè)些過程需花費大(dà)量的(de)時(shí)間。
常規光鏡（LM）觀察方法同樣存在(zài)上(shàng)述缺點。
圖1 顯示了(le／liǎo)使用表面平整的(de)鋁樣品座觀察矽藻的(de)局限性
（a）一(yī / yì ／yí)種羽紋綱淡水矽藻，僅能觀察到(dào)殼面結構，即使完全傾斜樣品座，也(yě)不(bù)能看到(dào)帶面結構，比例尺=5μm
（b）一(yī / yì ／yí)種海洋矽藻-骨條藻（Skeletonema sp.），僅能觀察到(dào)帶面結構，即使傾斜樣品座，也(yě)不(bù)能看到(dào)殼面結構，比例尺=10μm
解決方法
利用鑽石刻刀在(zài)掃描電鏡鋁樣品座上(shàng)劃網格，然後讓矽藻樣品随機地(dì / de)以(yǐ)不(bù)同角度落在(zài)樣品座表面及所刻的(de)槽内，籍此在(zài)光鏡和(hé / huò)掃描電鏡下能快速地(dì / de)獲得矽藻種類鑒定所需的(de)殼面和(hé / huò)帶面結構信息。
具體過程
1、 在(zài)鋁樣品座上(shàng)刻槽
2) 用雙蒸水（DDW）去除殘留的(de)碎屑；
3) 将樣品座固定于(yú)圖2a所示的(de)夾具内；
4) 以(yǐ)鋼尺爲(wéi / wèi)标尺，持圖2a-c所示的(de)鑽石刻刀在(zài)樣品座上(shàng)刻網格狀的(de)槽（圖2d-f），槽的(de)寬度爲(wéi / wèi)20-125μm，槽之(zhī)間的(de)間隔小于(yú)1mm；注意刻槽時(shí)，鑽石刻刀與樣品座表面垂直，控制好力度使所刻槽的(de)寬度、深度均勻，滿足矽藻觀察的(de)需要(yào / yāo)；
5) 用潤濕後的(de)1200目碳化矽砂紙輕輕打磨樣品座，去除刻槽過程中産生的(de)棱角；
6) 将樣品座放入肥皂液中刷洗，再用雙蒸水淋洗；
7) 待樣品座幹後，利用硬工作台上(shàng)折疊放置的(de)紙巾将樣品座表面抛光；或者用14000目（1-2μm）的(de)金剛砂輪或金剛砂片抛光；
8) 用100%的(de)乙醇清洗樣品座；
按上(shàng)述過程制作一(yī / yì ／yí)個(gè)樣品座，大(dà)約需6-10min。
2、 放置矽藻樣品
2) 洗滌：用足量的(de)雙蒸水去除清潔過程中所使用的(de)鹽（例如，使用家庭用漂白劑清潔，容易在(zài)樣品座和(hé / huò)樣品上(shàng)産生大(dà)量的(de)鹽，雙蒸水用量爲(wéi / wèi)100-150mL；用過氧化氫清潔，産生的(de)鹽少，雙蒸水用量相應減少）；
3) 離心：1600rpm轉速下離心30-40min，對于(yú)堅硬的(de)圓篩藻屬，可在(zài)3000rpm轉速下離心30min，而(ér)對于(yú)纖弱的(de)雙尾藻屬，最好采用自然沉降的(de)方法，沉降時(shí)間爲(wéi / wèi)2h以(yǐ)上(shàng)；
4) 加雙蒸水或雙蒸水/乙醇混合液（50–80%乙醇），吸取矽藻懸浮液滴在(zài)樣品座上(shàng)，使用乙醇混合液的(de)好處在(zài)于(yú)：無需使用烘箱，減少樣品幹燥時(shí)間；促進樣品運動，避免堆積，增大(dà)矽藻以(yǐ)不(bù)同角度沉積在(zài)樣品座上(shàng)的(de)概率；
5) 自然幹燥，過夜。（如使用烘箱，則在(zài)60°C下放置10-15min）；
6) 在(zài)立體顯微鏡下檢查矽藻位置、數量及分布情況，爲(wéi / wèi)滿足電鏡觀察的(de)要(yào / yāo)求，矽藻數量應足夠多，且無堆疊現象；
7) 鍍膜：在(zài)樣品座上(shàng)鍍Au/Pd或Au膜，厚度爲(wéi / wèi)8-15nm，以(yǐ)提高SEM觀察時(shí)的(de)信噪比，避免荷電現象發生；
8) 掃描電鏡觀察、拍照。
圖2 在(zài)SEM鋁樣品座上(shàng)刻槽
（a）夾具，鋼尺，刻槽
（b）鑽石刻刀
（c）刀尖
（d）刀尖角度
（e）常規的(de)SEM鋁樣品座
（f）網格狀凹槽
結果展示
如圖3-圖7所示。
圖3
（a）分散在(zài)網格狀樣品座上(shàng)的(de)海鏈藻（Thalassiosira punctigera），比例尺=75μm
（b）無需傾斜SEM樣品台，a中心的(de)2個(gè)海鏈藻（Thalassiosira punctigera），比例尺=20μm
（c）分散在(zài)凹槽内的(de)布氏雙尾藻（Ditylum brightwellii）（箭頭方向），凹槽寬度爲(wéi / wèi)70–125μm，凹槽之(zhī)間的(de)間距爲(wéi / wèi)200–800μm，比例尺=500μm
（d）c中凹槽内的(de)布氏雙尾藻，其殼面朝上(shàng)，單箭頭指向矽藻位置，雙箭頭顯示凹槽的(de)寬度爲(wéi / wèi)73μm，比例尺=20μm
圖4
（a）中心綱盒形藻（Biddulphia antediluviana）立體顯微鏡照片，殼面和(hé / huò)帶面結構均可見，比例尺=75μm
（b）凹槽内的(de)中心綱盒形藻（Biddulphia antediluviana）帶面方向的(de)SEM照片，比例尺=10μm
圖5
（a-b）凹槽内的(de)海洋矽藻-骨條藻（Skeletonema sp.），殼面和(hé / huò)帶面結構均可見，黑色箭頭顯示凹槽寬度爲(wéi / wèi)176μm，a、b中的(de)比例尺分别爲(wéi / wèi)20μm、10μm
圖6
（a）凹槽内的(de)卵形藻（Cocconeis sp.），殼面朝上(shàng)
（b）卵形藻（Cocconeis sp.）的(de)内部結構，需略微傾斜SEM樣品台，比例尺=20μm
圖7 立體顯微鏡拍攝的(de)矽藻照片，比例尺均爲(wéi / wèi)100μm
（a）中心綱海鏈藻（Thalassiosira sp.），角度特殊，可見帶面結構
（b）凹槽内的(de)海洋矽藻-具槽帕拉藻（Paralia sulcata），殼面、帶面結構均可見
結論
該方法使用具有網格狀凹槽的(de)樣品座，簡單、快速、經濟，與使用平整載體的(de)常規方法相比，更有利于(yú)全面觀察矽藻顯微形态。
（翻譯：胡孫林）
原文鏈接：
本公司提供原文中所述的(de)樣品制備工具鑽石刻刀（Diamond Scribe）、掃描電鏡鋁樣品座（Aluminum SEM Stub ）和(hé / huò)文末廣告中的(de)掃描電鏡放大(dà)倍率标樣MRS-6和(hé / huò)Evactron電鏡清洗儀（用于(yú)去除樣品室及樣品附着的(de)手印等污染物，提高電鏡分辨率），感興趣者，歡迎與我們聯系！
本文使用權歸廣州競赢科學所有，如需轉載，請注明出(chū)處；若涉版權問題，請與我們聯系。
