如何制備透射電鏡（80-120kV）生物樣品？

作者：孫千 本文轉載自公衆号：老千和(hé / huò)他(tā)的(de)朋友們。原文地(dì / de)址：https://mp.weixin.qq.com/s/oLe7r8QTg6ZK8FZ09zhk_g

與幹燥和(hé / huò)濃縮的(de)材料樣品不(bù)同，大(dà)多數生物樣品都是(shì)含水的(de)或水合的(de)，含有大(dà)量的(de)水分。它們質地(dì / de)柔軟，由H、C、N、O、S和(hé / huò)P等輕元素組成，且不(bù)具有導電性。因此，生物樣品的(de)制備需要(yào / yāo)多個(gè)步驟才能獲得TEM樣品。生物樣品通常包括顆粒樣品以(yǐ)及細胞和(hé / huò)組織樣品。

1、顆粒樣品

如果樣品是(shì)含有顆粒或纖維的(de)液體溶液，可以(yǐ)在(zài)室溫下通過負染色法制備，或在(zài)低溫下通過快速冷凍法制備。

負染色過程如圖1所示。通常情況下，未經染色的(de)顆粒在(zài)TEM中呈現爲(wéi / wèi)暗色圖像，這(zhè)是(shì)因爲(wéi / wèi)顆粒散射和(hé / huò)吸收入射電子(zǐ)（散射吸收對比度）。然而(ér)，含水樣品不(bù)能直接放入TEM進行成像。負染色需要(yào / yāo)使用含重金屬的(de)化學物質來(lái)覆蓋或部分覆蓋顆粒，具體取決于(yú)樣品、支撐膜和(hé / huò)染料的(de)性質。在(zài)任何情況下，當樣品幹燥後進行成像時(shí)，在(zài)TEM投影中，顆粒樣品區域呈現較亮的(de)對比度，因爲(wéi / wèi)其周圍區域含有較厚的(de)染料。因此，與常規圖像相比，這(zhè)種顆粒呈現相反的(de)對比度。

圖1負染色。(a) 不(bù)使用染色劑時(shí)，顆粒在(zài)TEM下呈現爲(wéi / wèi)暗色圖像；(b-e) 根據染色劑與樣品和(hé / huò)支持膜之(zhī)間的(de)性質關系，負染色可呈現不(bù)同形式；(f) 樣品經負染色後的(de)TEM圖像，其中顆粒的(de)對比度與(a)相比呈現相反效果；(g) 肽納米纖維的(de)TEM圖像，呈現爲(wéi / wèi)亮色對比度；(h) 通過快速冷凍制備的(de)肽納米纖維的(de)TEM圖像，由于(yú)它們被凍結在(zài)冰中，因此直接成像時(shí)呈現暗色對比度。

負染色可以(yǐ)通過以(yǐ)下方法進行：

1. 準備染色液。

2. 對帶有支撐膜的(de)TEM載網進行輝光放電，以(yǐ)增加其親水性。

3. 使用一(yī / yì ／yí)對自閉式鑷子(zǐ)夾住載網，在(zài)載網上(shàng)放置1-3μL樣品溶液。用濾紙吸去多餘的(de)樣品液體。

4. 約10秒後，緩慢移液20μL染料（醋酸鈾、磷鎢酸、矽鎢酸鈉）。在(zài)向載網上(shàng)移液時(shí)，用濾紙條輕輕吸取對面的(de)染料。吸去載網上(shàng)的(de)多餘液體。

5. 将載網在(zài)空氣中幹燥。

 

也(yě)可以(yǐ)在(zài)石蠟膜表面放置一(yī / yì ／yí)滴（約100mL）染色液，在(zài)上(shàng)述步驟4中，将TEM載網翻轉并使其漂浮在(zài)染色液的(de)表面上(shàng)20秒，然後取出(chū)并在(zài)空氣中幹燥。

另一(yī / yì ／yí)種負染色方法是(shì)将樣品溶液和(hé / huò)染料按1:1比例混合，然後将混合溶液施加到(dào)載網上(shàng)。

樣品也(yě)可以(yǐ)進行正染色，使染料與樣品形成複合物，這(zhè)樣顆粒在(zài)TEM中呈現暗色對比度。這(zhè)樣，正染色會增加樣品的(de)電子(zǐ)不(bù)透明度，使樣品呈現更暗的(de)顔色，而(ér)負染色的(de)樣品相對于(yú)周圍的(de)染料仍然保持較高的(de)電子(zǐ)透明度。負染色在(zài)實驗室實踐中已經成爲(wéi / wèi)常規使用的(de)方法。

圖1(g)顯示了(le／liǎo)使用2 wt.%醋酸鈾水溶液進行負染色制備的(de)水凝膠形成肽的(de)TEM圖像。納米纖維相對于(yú)周圍區域呈現較亮的(de)對比度。作爲(wéi / wèi)對比，圖1(h)顯示了(le／liǎo)通過快速冷凍制備并在(zài)低溫下成像的(de)納米纖維。這(zhè)些纖維被包埋在(zài)冰中，沒有使用其他(tā)化學物質，因此呈現較暗的(de)對比度。

2、細胞和(hé / huò)組織樣品

生物細胞和(hé / huò)組織樣品含有大(dà)量的(de)水分。爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)在(zài)高真空TEM中觀察樣品，樣品固定是(shì)最重要(yào / yāo)和(hé / huò)最關鍵的(de)步驟之(zhī)一(yī / yì ／yí)。通過适當的(de)固定，細胞或組織的(de)超微結構可以(yǐ)盡可能地(dì / de)保持接近活體樣品的(de)狀态。樣品可以(yǐ)在(zài)室溫下通過化學固定進行經典制備，或在(zài)低溫下通過冷凍固定進行冷凍制備。制備TEM樣品需要(yào / yāo)多個(gè)步驟，如圖2所示。

圖2生物樣品制備的(de)主要(yào / yāo)途徑

經典的(de)室溫制備包括以(yǐ)下步驟：

1.樣品提取。用刀取出(chū)一(yī / yì ／yí)小塊具有代表性的(de)樣品（尺寸約爲(wéi / wèi)厘米級），如圖3(a)所示。

2. 固定。包括以(yǐ)下步驟：

a. 預固定（固定蛋白質）使用2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液。将提取的(de)組織放在(zài)載玻片上(shàng)，在(zài)樣品上(shàng)滴加戊二醛溶液（圖3a）。使用兩片刀片切割樣品以(yǐ)減少變形（圖3b）。用鑷子(zǐ)将樣品轉移到(dào)裝有戊二醛溶液的(de)玻璃瓶中（圖3c）。

b. 用磷酸鹽緩沖液清洗樣品兩到(dào)三次。

c. 後固定（固定脂質）使用1%-2%四氧化锇磷酸鹽緩沖液。

d. 用磷酸鹽緩沖液清洗。

3. 脫水。樣品通過丙酮或乙醇系列進行脫水，步驟如下：50%乙醇（10分鍾）→70%乙醇（10分鍾）→80%乙醇（10分鍾）→90%乙醇（10分鍾）→95%乙醇（10分鍾）→100%乙醇（20分鍾）→100%乙醇（20分鍾）。

4. 置換。僅使用環氧丙烷（PO）并更換液體兩到(dào)三次（每次20分鍾）。

5.包埋。使用新配制的(de)樹脂包埋樣品（圖3d）。将樣品放入矽膠包埋闆的(de)孔中，将樹脂倒在(zài)組織上(shàng)。确保樹脂中沒有氣泡。根據所用樹脂的(de)具體要(yào / yāo)求在(zài)适當條件下使樹脂聚合。

6. 超薄切片。

7.染色。用重金屬鹽（醋酸鈾和(hé / huò)檸檬酸鉛溶液）進行後染色可以(yǐ)增強對比度。在(zài)封口膜上(shàng)放一(yī / yì ／yí)滴醋酸鈾溶液，将載網薄切面朝下漂浮在(zài)液滴上(shàng)與染料反應10分鍾（圖3e）。用水輕輕沖洗。将載網在(zài)檸檬酸鉛溶液液滴上(shàng)染色10分鍾，然後用水輕輕沖洗并風幹。

8. TEM觀察。生物樣品通常在(zài)較低電壓（80-120 kV）下觀察以(yǐ)增強對比度，而(ér)在(zài)大(dà)多數情況下，生物樣品不(bù)需要(yào / yāo)高分辨率，因此可以(yǐ)使用較低電壓。

圖3 細胞和(hé / huò)組織樣品制備。(a-c) 預固定并切成小塊；(d) 環氧樹脂包埋；(e) 醋酸鈾和(hé / huò)檸檬酸鉛後染色；(f) TEM和(hé / huò)(g) STEM單個(gè)O. danica細胞圖像。字母“P”代表細胞質膜，“V”代表液泡，“C”代表葉綠體。

圖3f（TEM）和(hé / huò)圖3g（STEM）展示了(le／liǎo)單個(gè)金藻細胞的(de)示例。簡而(ér)言之(zhī)，液态藻類樣品首先與Trump固定液混合，然後通過0.45微米孔徑的(de)塑料濾膜過濾，使細胞停留在(zài)濾膜表面。随後将細胞在(zài)1%（毫克/毫升，重量體積比）四氧化锇（溶于(yú)0.1 M HEPES緩沖液，pH 7.4）中染色約0.5小時(shí)，并通過甲醇（10%-100%）脫水。之(zhī)後，将其包埋在(zài)環氧樹脂中并切成100納米厚度的(de)切片用于(yú)TEM和(hé / huò)STEM分析。在(zài)低倍率下可以(yǐ)觀察到(dào)細胞附着在(zài)濾紙上(shàng)。

參考資料

Luo, Z. (2016). A practical guide to transmission electron microscopy : fundamentals (First edition). Momentum Press.

J.J. Bozzola, L.D. Russell. Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. Jones and Bartlett Learning, Massachusetts, 1999

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