來(lái)源：Mowery, Joseph & Bauchan, Gary. (2018). Optimization of Rapid Microwave Processing of Botanical Samples for Transmission Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24. 1202-1203. 10.1017/S1431927618006499.
▍前言
傳統的(de)TEM樣品制備，尤其是(shì)對于(yú)結構複雜的(de)植物樣品，其漫長的(de)處理周期（通常需要(yào / yāo)3-4天）一(yī / yì ／yí)直是(shì)制約研究效率的(de)瓶頸。試劑緩慢的(de)滲透擴散速率，常常讓研究人(rén)員在(zài)等待中消耗寶貴的(de)時(shí)間。
今天，爲(wéi / wèi)大(dà)家介紹一(yī / yì ／yí)項由美國(guó)農業部農業研究局（USDA-ARS）電子(zǐ)與共聚焦顯微鏡部門的(de) Joseph Mowery 和(hé / huò) Gary Bauchan 研究員帶來(lái)的(de)優化技術，該技術利用快速微波處理，可以(yǐ)優化植物樣品TEM制備的(de)流程。
▍微波技術：加速滲透的(de)利器
微波（MW）輻射技術并非全新概念，它通過加速試劑分子(zǐ)運動，極大(dà)地(dì / de)提高了(le／liǎo)試劑向組織内部的(de)擴散速率，有望将整個(gè)制備流程從數天縮短至幾小時(shí)内。然而(ér)，随着現代微波處理系統（如本研究使用的(de) Pelco BioWave Pro+）的(de)不(bù)斷進步，針對特定樣品類型（尤其是(shì)植物樣品）優化處理方案顯得尤爲(wéi / wèi)重要(yào / yāo)和(hé / huò)迫切。植物樣品因其獨特的(de)結構，往往需要(yào / yāo)額外的(de)處理步驟，這(zhè)也(yě)正是(shì)本研究的(de)焦點所在(zài)。
▍挑戰與優化：攻克植物樣品的(de)特殊難題
研究團隊以(yǐ)煙草（Nicotiana tabacum）和(hé / huò)番茄（Solanum lycopersicum）的(de)葉片組織爲(wéi / wèi)模型，進行了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)系列細緻的(de)優化工作。
▶ 樣品均一(yī / yì ／yí)性與滲透效率：
• 關鍵： 微波處理中，樣品尺寸和(hé / huò)一(yī / yì ／yí)緻性至關重要(yào / yāo)。
• 優化： 使用1毫米打孔器取樣，确保大(dà)小一(yī / yì ／yí)緻。
▶ 克服“漂浮”難題：
• 挑戰： 植物葉片含氣易漂浮，影響滲透。
• 優化：
– 真空/常壓循環去空氣。
– 加0.2% Tween-20助沉降。
▶ 解決樹脂粘附難題：
• 挑戰： 蠟質角質層緻樹脂粘附不(bù)良。
•優化：脫水時(shí)加Z-6040矽烷偶聯劑增粘附。
▶ 樹脂滲透與聚合：
• 流程： 梯度脫水、過渡、樹脂滲透。
• 優化： 采用兩步法水下微波聚合。
▍優化後的(de)詳細流程
| 步驟 | 時(shí)間 | 功率(W) | 真空 | 溫度(°C) |
|---|---|---|---|---|
| 固定液 / 真空 (x5-10) | 2分真空, 2分放氣 (x5-10) | 0 | 開 | 60 |
| 初級固定 | 2分開, 2分關, 2分開 | 150 | 循環¹ | 60 |
| 初級固定 (強化) | 10秒開, 20秒關, 10秒開 | 650 | 開 | 60 |
| 緩沖液漂洗 | 1 分鍾 | 150 | 循環 | 60 |
| 1% OsO₄ 後固定 | 5開, 2關, 5開, 2關, 5開 | 200 | 循環 | 60 |
| 緩沖液漂洗 | 1 分鍾 | 150 | 循環 | 60 |
| 4% 醋酸鈾染色 | 2分開, 2分關, 2分開 | 150 | 循環 | 60 |
| 25% EtOH, 1% Z-6040 | 5 分鍾 | 250 | 循環 | 60 |
| 50% EtOH, 1% Z-6040 | 5 分鍾 | 250 | 循環 | 60 |
| 75% EtOH, 1% Z-6040 | 5 分鍾 | 250 | 循環 | 60 |
| 85% EtOH, 1% Z-6040 | 5 分鍾 | 250 | 循環 | 60 |
| 95% EtOH | 5 分鍾 | 250 | 循環 | 60 |
| 100% EtOH (x3) | 5 分鍾 (x3) | 250 | 循環 | 60 |
| 100% PO (x2) | 5 分鍾 (x2) | 250 | 關 | 60 |
| 25% LX-112 Resin | 20 分鍾 | 250 | 循環 | 60 |
| 50% LX-112 Resin | 20 分鍾 | 250 | 循環 | 60 |
| 75% LX-112 Resin | 20 分鍾 | 250 | 開 | 60 |
| 100% LX-112 Resin (x4) | 20 分鍾 (x4) | 250 | 開 | 60 |
| 聚合 Step 1 | 30 分鍾 | 250 | 關 | 60 |
| 聚合 Step 2 | 90 分鍾 | 450 | 關 | 100 |
*注：真空循環指在(zài)20英寸汞柱下每30秒開關一(yī / yì ／yí)次真空。聚合步驟在(zài)密封的(de)Beem膠囊中水下進行。EtOH=乙醇, PO=環氧丙烷。
▍結果與意義：更快、更好
通過應用這(zhè)一(yī / yì ／yí)系列優化措施，研究團隊不(bù)僅顯著縮短了(le／liǎo)樣品處理時(shí)間，更重要(yào / yāo)的(de)是(shì)：
- •超微結構保存改善： 與傳統方法比有輕微改善。
- •微波聚合優勢： 形态保存有優勢。
(圖1：微波處理樣品超微結構。)
PELCO BioWave Pro+ 微波快速組織處理儀介紹
